國璽專欄
2024/10/25
外泌體的純化與分析技術：基於MISEV2023的指導準則
外泌體（Exosomes）是細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的一種，廣泛參與細胞間通訊和多種生理病理過程。為了研究外泌體的功能和應用，純化和分析至關重要。
《MISEV2023》針對外泌體的研究提出了詳細的純化和分析指導準則，以確保一致性和結果的可靠性。以下是根據《MISEV2023》對純化技術和分析方法的摘要。
1. 純化（Isolation and Purification）
- 多步驟純化流程：為了提高EVs的純度，建議採用多步驟純化流程。其中包括：
差速離心：通過逐步增加離心速度來分離細胞碎片和大顆粒。
超速離心：用於沉澱EVs，可搭配其他技術以減少蛋白質等污染物。
密度梯度離心：將EVs分離出來，通常使用蔗糖或碘化鈣等密度梯度介質。
尺寸排阻層析：利用EVs的大小特性來分離。
- 技術選擇依賴於樣品類型：例如，生物流體 (牛奶等)或細胞培養液需要不同的前處理或純化技術。MISEV2023建議根據樣品特性和下游應用的需求來選擇最適合的純化方式。
- 去除污染物：強調去除可溶性蛋白質、脂質體和其他細胞碎片的重要性。建議使用過濾或柱層析來提高純度。
- 標準化與透明化：純化方法應被標準化，且詳細報告所有參數，如離心力、時間、密度介質等，以確保可重複性和透明度。
2. 分析（Characterization and Analysis）
純化外泌體後，確保其質量和純度至關重要。通常採用以下鑑定技術來確認外泌體的品質：
- 表徵的多層次分析： MISEV2023建議使用多種分析技術進行多層次表徵，其中包括：
顆粒大小和濃度測量：如納米顆粒追蹤分析（NTA）、動態光散射（DLS）和電子顯微鏡（TEM），這些技術可以測定EVs的大小分布和濃度。
表面標記物分析：利用流式細胞儀（FCM）和西方墨點法（Western Blot）來檢測EVs表面的標記物（如CD9、CD63、CD81）。
內容物分析：分析EVs內的蛋白質與核酸物質等，以探索功能性。建議使用質譜（MS）、RNA測序等進行分析。 - 品質控制：強調分析過程中的品質控制，包括多次測定以保證數據的一致性，並採用對照組來確認結果的準確性。
- 綜合數據呈現：MISEV2023強調報告的完整性，建議提供顆粒大小分布圖、標記物的數據等詳細資訊。
總結來說，《MISEV2023》為外泌體的純化和分析提供詳盡的指導，以確保外泌體的品質。透過多層次的純化技術和精準的分析方法，能更準確地蒐集與鑑別外泌體。
參考資料
- Welsh, Joshua A et al. “Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.” Journal of extracellular vesicles vol. 13,2 (2024): e12404. doi:10.1002/jev2.12404